1 背景介绍
感染性疾病是导致人类死亡的首要原因，也是儿童死亡排在第一位的原因，是当之无愧的人类头号杀手。
全球 | 中国 |
据WHO报道感染性疾病导致患者死亡占全部死因的25%以上 | 感染性疾病占所有疾病的50%以上 |
每年1300万儿童死于感染性疾病 | 造血系统肿瘤患者75%死于感染 |
| 实体肿瘤患者50%死于感染 |
感染性疾病是人类头号杀手，是导致儿童死亡第一位原因。抗生素的滥用，使疾病难以控制，也使病原体产生耐药性，甚至形成超级细菌。
2 病原微生物宏基因组测序（mNGS）介绍
病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而病原微生物宏基因组测序（mNGS）技术检测能覆盖更广范围的病原体。mNGS，是对患者样本中微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）的全面分析。如今它正迅速从科学研究转向临床诊断应用，它尤其擅长鉴别罕见、新发、难以检测和混合感染的病原体。2019年底，我国学者就是借助mNGS技术，仅仅数天时间就确认新冠肺炎是由一种新的冠状病毒引起的呼吸道传染性疾病，而2003年确认SARS的病原时，我们用了5个月的时间。如果把传统针对特定病原的检测看成是“钓鱼”，那么mNGS就类似于“大面积撒网捕捞”。自2008年以来，来自20多个国家的大量研究表明，mNGS应用范围广泛，包括病原体检测鉴定、抗生素耐药性分析、微生物组分析、抗感染疗效评价、人类宿主基因表达转录组学和肿瘤学等多个方面。尤其是在诊断不明原因的感染性疾病方面，mNGS表现突出，在药物敏感性预测中具有巨大潜力，成为优化治疗方案和抗菌药物管理的重要辅助检测工具。由此，许多医生认为mNGS是解决临床感染难题的新利器，有望改变医生对感染性疾病的诊断和治疗实践。
mNGS检测技术的特点
传统的感染性疾病原微生物鉴定方法的主要思路为，先假设、后试验、再验证。可以鉴定的微生物种类有限，而不依赖假设的mNGS方法则具有检测所有种类微生物的潜力。
方法 | 优点 | 缺点 |
PCR检测 | 简单、快速、价格低廉，可以定量检测、准确性高 | 依赖主观假设，检测已知的微生物，需要引物扩增，但是引物并不总是可靠，只能检测微生物基因组的很小一部分 |
培养法 | 可适应较大的样本体积，价格低廉，“金标准”，研究比较透 | 检测敏感度受限于培养时抗生素的使用，有些微生物难以培养，无法检测病毒，检测周期长 |
质谱法 | 过程简单，特异性和准确性都很高，可进行高通量分析 | 基于已培养的阳性菌落，依赖培养，只能检测细菌和真菌约1000种已知微生物，部分病原体不能鉴定到种，只能定性而不能定量检测 |
免疫学检测 | 时效性强，周期1-3天，价格便宜，操作流程简单，可检测支原体、衣原体、病毒等 | 敏感性和特异性差，并不是所有的病原微生物都有相应的抗体，有窗口期、假阳性高 |
mNGS法 | 客观检测，不依赖假设、可以检测任意微生物，可以发现新的病原微生物，可以定量检测核酸，可以检测基因组的任一部分 | 检测结果受宿主背景微生物组成影响，对样本要求高，易受其他部位的样本污染，易受环境微生物污染，时效性不如核酸检测PCR，动辄数千元的检测价格对于普通家庭属于高医疗费用 |
tNGS法 | 不受人类基因组及背景菌影响，强化耐药基因检测性能，更高的检测性价比，能够对低丰度的病原体进行高灵敏度的检测 | 不能检测未知微生物 |
mNGS主要应用范围包括疑似的中枢神经系统（CNS）感染、血流感染、局灶性感染、呼吸系统感染等方面。疑似中枢神经系统感染适用范围：怀疑CNS急性感染、疑似神经系统病毒感染以及慢性CNS感染和需要随访病原学证据的患者。怀疑血流感染适用范围：血培养3天内阴性且经验性抗感染治疗无效时、原发感染灶病原检测阴性或因各种因素无法送检合适标本的情况可考虑送检血液标本进行病原mNGS。疑似局灶性感染适用范围：局灶部位在完成常规生化、培养或PCR检测未能获取病原学证据时。疑似呼吸道感染适用范围：3天内未通过传统检测获得明确病原学依据且经验抗感染无效、高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展，完善呼吸道病毒多重PCR检测为阴性患者。病原微生物靶向测序（targeted NGS,tNGS）技术将超多重PCR与高通量测序技术相结合，可同时检测样本中几十至几百种常见病原微生物及其耐药基因，在提高灵敏度的同时，降低了测序数据量，实现了成本及性能的双重优化。与mNGS广覆盖、无偏倚不同，tNGS利用靶向扩增或捕获的方式，可用于检测一组病原体、基因子集或感兴趣的特定基因组区域。并且，tNGS所需数据量更小，检测速度更快，数据分析以及报告生成也更快。今年，《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》正式发表，也是首个tNGS相关专家共识。内容涵盖技术概况、技术特点、临床适应征和送检时机、标本采集、临床结果判读等五大方面，重点提到了分枝杆菌靶向测序应用于结核/NTM病以及耐药的诊断优势，为在分枝杆菌病诊断过程中合理使用高通量测序技术提供参考。
适用人群
精神状态改变，合并神经系统局部病灶，影像学实质性病灶，脑电图异常等；
不明原因发热、脓毒血症、感染性休克等；
重症肺炎、肺部阴影、气管插管、呼吸机等；
胸腔、尿路等其他部位感染。
4.1 血流感染常见病原
CHINET计划中十家大型教学医院的血培养样本的2861个菌株中，排名前10位的病原体是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、链球菌、肠杆菌和念珠菌。CABSI（社区获得性）：大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的流行率高HABSI（医院获得性）：肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的比例高ICU患者：鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌的比例更高
4.2 中枢神经系统感染常见病原
2009年至2018年期间，招募了20,454名急性脑炎脑膜炎患者，9079名病毒感染患者中，28.43%的患者至少有1种病毒检测呈阳性。18岁以下儿童中最常检测到的病毒是肠道病毒，18-59岁和≥60岁年龄组中最常检测到的病毒分别是单纯疱疹病毒和乙型脑炎病毒。6802名细菌感染患者中，4.43%的患者至少有一种细菌检测呈阳性，5岁以下和5-17岁儿童的主要细菌分别是肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌。18-59岁和≥60岁的成年人中最常见金黄色葡萄球菌。
4.3 呼吸系统感染常见病原
2009-2019年全国范围内全年龄段急性呼吸道感染患者监测结果表明：最常见的病毒病原体为流感病毒（IFV，28.5%），其次为呼吸道合胞病毒（RSV，16.8%）、人鼻病毒 (HRV，16.7%)、人副流感病毒 (HPIV，13.1%)、人腺病毒 (HAdV，10.3%)、人冠状病毒 (HCoV，5.8%)、人博卡病毒 (HBoV，4.6%)和人偏肺病毒 (HMPV，4.1%)；最常见的细菌为肺炎链球菌（29.9%）、肺炎支原体（18.6%）、流感嗜血杆菌（15.8%）、肺炎克雷伯菌（12.5%）、铜绿假单胞菌（11.4%）、金黄色葡萄球菌（8.9%）。对于成年人和老年人，肺炎的病原体谱与非肺炎仅略有不同。
tNGS和mNGS各有优势和局限性，它们在不同的场景下有着不同的适用性。tNGS的优势是能够对低丰度的病原体进行高灵敏度的检测，同时降低测序数据量和分析工作量，提高检测效率和成本效益；但是tNGS的局限性是只能检测预先设计好的病原体，无法发现新型或罕见的病原体，也无法对病原体进行全基因组分析。mNGS的优势是能够对样本中的所有病原体进行无偏向的检测，发现新型或罕见的病原体，同时提供病原体的全基因组信息，有利于溯源、分型和耐药评估等；但是mNGS的局限性是需要较大的测序数据量和分析工作量，检测成本和时间较高，对低丰度的病原体检测灵敏度较低。因此，tNGS和mNGS并不是相互替代的关系，而是相互补充和协同的关系。在临床微生物学领域，tNGS更适合于常见或已知病原体的快速筛查和诊断，而mNGS更适合于未知或罕见病原体的探索和鉴定。两种技术结合使用，可以实现更全面、更准确、更高效的病原体检测。
[1]. Itai Sharon and Jillian F. Banfi eld. Genomes from Metagenomics. Science, 2013, 342: 1057-1058.[2]. Wei Gu et al. Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen DetectionAnnu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2019. 14:317–36.[3]. Michael R. Wilson et al. Actionable Diagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing. N Engl J Med, 2014, 370:2408-17.[4]中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识.[J]中华传染病杂志.2020.[5]宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识.[J]中华检验医学杂志.2021.[6]宋振举等.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J].中华急诊医学杂志,2019.
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